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    ELISA原理介绍
    公布日期:2015/3/30      欣赏:4575

    1.ELISA的原理

    ELISA的底子是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标志。联合在固相载体外表的抗原或抗体仍坚持其免疫学活性,酶标志的抗原或抗体既保存其免疫学活性,又保存酶的活性。在测定时,受检标本(测定此中的抗体或抗原)与固相载体外表的抗原或抗体起反响。用洗濯的办法使固相载体上构成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质离开。再参加酶标志的抗原或抗体,也经过反响而联合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈肯定的比例。参加酶反响的底物后,底物被酶催化成为有色产品,产品的量与标本中受检物质的量间接相干,故可依据呈色的深浅举行定性或定量剖析。由于酶的催化服从很高,直接地缩小了免疫反响的后果,使测定办法到达很高的敏感度。

    2.ELISA的范例

    ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定办法中有三个须要的试剂:

    (1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);

    (2)酶标志的抗原或抗体,称为"联合物"(conjugate);

    (3)酶反响的底物。

    依据试剂的泉源和标本的状况以及检测的详细条件,可设计出种种差别范例的检测办法。

    用于临床查验的ELISA次要有以下几品种型:

    2.2.1双抗体夹心法测抗原

    双抗体夹心法是检测抗原最常用的办法,操纵步调如下:

    1)将特异性抗体与固相载体团结,构成固相抗体。洗濯撤除未联合的抗体及杂质。

    2)加受检标本,保温反响。标本中的抗原与固相抗体联合,构成固相抗原抗体复合物。洗濯撤除其他未联合物质。

    3)加酶标抗体,保温反响。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体联合。彻底洗濯未联合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相干。

    4)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产品。经过比色,测知标本中抗原的量。在临床查验中,此法实用于查验种种卵白质等大分子抗原,比方HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只需取得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶联合物而创建此法。如抗体的泉源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好辨别取自差别种属的植物。如使用单克隆抗体,一样平常选择两个针反抗原上差别决议簇的单抗,辨别用于包被固相载体和制备酶联合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性,并且可以将受检标本和酶标抗体一同保温反响,作一步检测。

    在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原辨别和固相抗体及酶标抗体联合,而不再构成"夹心复合物"。类同于沉淀反响中抗原过剩的后带征象,此时反响后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与尺度曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相反,如按常法测读,所得后果将低于实践的含量,这种征象被称为钩状效应(hookeffect),由于尺度曲线抵达岑岭后呈钩状弯落。钩状效应严峻时,反响乃至可不显色而呈现假阴性后果。因而在利用一步法试剂测定标本中含量可非常增高的物质(比方血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时,应留意可测范畴的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可减弱钩状效应。

    倘使在被测分子的差别位点上含有多个相反的决议簇,比方HBsAg的a决议簇,也可用针对此决议的统一单抗辨别包被固相和制备酶联合物。但在HBsAg的检测中应留意亚型题目,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,固然每种亚型均有相反的a决议簇的反响性,这也是用单抗作夹心法应留意的题目。

    双抗体夹心法测抗原的另一留意点是类风湿因子(RF)的搅扰。RF是一种本身抗体,多为IgM型,能和多种植物IgG的Fc段联合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充任抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体联合,体现出假阳性反响。接纳F(ab')或Fab片断作酶联合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消弭RF的搅扰。双抗体夹心法ELISA试剂能否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项稽核目标。

    双抗体夹心法实用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不实用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不克不及构成两位点夹心。

    2.2.2双抗原夹心法测抗体

    反响形式与双抗体夹心法相似。用特异性抗原举行包被和制备酶联合物,以检测响应的抗体。与直接法测抗体的差别之处为以酶标抗原取代酶标抗抗体。此法中受检标本不需浓缩,可间接用于测定,因而其敏感度绝对高于直接法。乙肝标记物中抗HBs的检测常接纳本法。本法要害在于酶标抗原的制备,应依据抗原布局的差别,寻觅符合的标志办法。

    2.2.3直接法测抗体

    直接法是检测抗体常用的办法。其原理为使用酶标志的抗抗体(抗人免疫球卵白抗体)以检测与固相抗原联合的受检抗体,故称为直接法。操纵步调如下:

    1)将特异性抗原与固相载体团结,构成固相抗原。洗濯撤除未联合的抗原及杂质。

    2)加浓缩的受检血清,保温反响。血清中的特异抗体与固相抗原联合,构成固相抗原抗体复合物。经洗濯后,固相载体上只留下特异性抗体,血清中的其他成份在洗濯历程中被洗去。

    3)加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体,但一样平常多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体联合,从而直接地标志上酶。洗濯后,固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相干。

    4)加底物显色

    本法次要用于对病原体抗体的检测而举行流行症[liú háng zhèng]的诊断。直接法的好处是只需变更包被抗原就可使用统一酶标抗抗体创建检测响应抗体的办法。

    直接法乐成的要害在于抗原的纯度。固然偶然用粗提抗原包被也能获得实践无效的后果,但应尽大概予以纯化,以进步实验的特异性。分外应留意撤除能与一样平常安康人血清产生反响的杂质,比方以E.Coli为工程酶的重组抗原,如此中含有E.Coli成份,很大概与受过E.Coli熏染者血甭中的抗E.Coli抗体产生反响。抗原中也不克不及含有与酶标抗人Ig反响的物质,比方来自人血浆某人体构造的抗原,如不将此中的Ig去除,实验中也产生假阳性反响。别的如抗原中含有有关卵白,也会因竟争吸附而影响包被结果。

    直接法中另一种搅扰要素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小局部。IgG的吸附性很强,非特异IgG可间接吸附到固相载体上,偶然也可吸附到包被抗原的外表。因而在直接法中,抗原包被后一样平常用有关卵白质(比方牛血清卵白)再包被一次,以关闭(blocking)固相上的空余间隙。别的,在检测历程中标本须先行浓缩(1:40~1:200),以制止过高的阴性本底影响后果的判别。

    2.2.4竞争法测抗体

    当抗原质料中的搅扰物质不易撤除,或不易失掉充足的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和肯定量的酶标抗体竞争与固相抗原联合。标本中抗体量越多,联合在固相上的酶标抗体愈少,因而阳性反响呈色浅于阴性反响。如抗原为高纯度的,可间接包被固相。如抗原中会有搅扰物质,间接包被不易乐成,可接纳捕捉包被法,即先包被与固相抗原响应的抗体,然后参加抗原,构成固相抗原。洗濯撤除抗原中的杂质,然后再加标本和酶标抗体举行竞争联合反响。竞争法测抗体有多种形式,可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争联合,抗HBcELISA一样平常接纳此法。另一种形式为将标本与抗原一同参加到固相抗体中举行竞争联合,洗濯后再参加酶标抗体,与联合在固相上的抗原反响。抗HBe的检测一样平常接纳此法。

    2.2.5竞争法测抗原

    小分子抗原或半抗缘故原由缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因而不克不及用双抗体夹心法举行测定,可以接纳竞争法形式。其原理是标本中的抗原和肯定量的酶标抗原竞争与固相抗体联合。标本中抗原量含量愈多,联合在固相上的酶标抗原愈少,最初的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

    2.2.6捕捉包被法测抗体

    IgM抗体的检测用于流行症[liú háng zhèng]的晚期诊断中。直接法ELISA一样平常仅实用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的直接法间接测定IgM抗体,因标本中一样平常同时存在较高浓度的IgG抗体,后者将竞争联合固相抗原而使一部份IgM抗体不克不及联合到固相上。因而如用抗人IgM作为二抗,直接测定IgM抗体,必需先将标本用A卵白或抗IgG抗体处置,以撤除IgG的搅扰。在临床查验中测定抗体IgM时多接纳捕捉包被法。先用抗人IgM抗体包被固相,以捕捉血清标本中的IgM(此中包罗针反抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM)。然后参加抗原,此抗原仅与特异性IgM相联合。继而加酶标志针反抗原的特异性抗体。再与底物作用,呈色即与标本中的IgM成正相干。此法常用于病毒性熏染的晚期诊断。

    类风湿因子(RF)异样无能扰捕捉包被法测定IgM抗体,招致假阳性反响。因而中和IgG的直接法迩来颇受喜爱,用这类试剂检测抗CMVIgGM和抗弓形虫IgM抗体已获乐成。

    2.2.7ABS-ELISA法

    ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)体系(system)的略语。亲和素是一种糖卵白,分子量60000,每个分子由4个能和生物素联合的亚基构成。生物素为小分子化合物,分子量244。用化学办法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与卵白质和糖等多品种型的巨细分子构成生物素标志产品,标志办法颇为轻便。生物素与亲和素的联合具有很强的特异性,其亲和力较抗原抗体反响大得多,两者一经联合就极为波动。由于一个亲和素可与4个生物素分子联合,因而如把ABS与ELISA法可分为酶标志亲和素-生物素(LAB)法和桥联亲和素-生物素(ABC)法两品种型。两者均以生物素标志的抗体(或抗原)取代原ELISA体系中的酶标抗体(抗原)。在LAB中,固相生物素先与不标志的亲和素反响,然后再加酶标志的生物素以进一步进步敏感度。在晚期,亲和素从蛋清中提取,这种卵亲和素为碱性糖卵白,与聚苯乙烯载体的吸附性很强,用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺陷,在ELISA使用中有替换前者的趋向。由于ABS-ELISA较平凡ELISA多用了两种试剂,增长了操纵步调,在临床查验中ABS-ELISA使用未几。

     
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