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    酶标志抗体的制备
    公布日期:2016/6/16      欣赏:5367
    (一)酶标抗体的条件
    1.纯度高、含杂卵白少,用IgG优于血清抗体,用Fab优于IgG。
    2.特异性强 即抗IgG与IgG在免疫电泳上只要一条沉淀线,与IgG的全血清也只要一条沉淀线,这才算是特异性的单价抗体。
    3.效价高 一样平常琼脂分散判定为1︰64以上才算及格。
    (二)酶标志办法
    1.交联法 交联法通常用的交联剂是戊二醛,戊二醛商品大多为25%的水溶液,使用戊二醛分子上对称的两个醛基,辨别与酶和卵白质分子中游离的氨基、酚基等以共价键联合而举行标志。标志时应只管即便接纳奇怪纯品,当戌二醛的OD235nm/OD280nm<3时,即为好的交联剂。
    戊二醛交联法又分为一步法和二步法。 
    ⑴ 一步法:即把酶、戊二醛和抗体一同参加举行交联。然后透析出过量的戊二醛而制备出具有高分子量的酶联合物。由于抗体分子量大(16万),酶分子量小(4万),抗体分子的氨基数比酶卵白分子氨基数多得多,后果天生的抗体-戊二醛或抗体-戊二醛-抗体多而形成酶标物的活性小。一步法操纵:①抗IgG-AKP的制备:将10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中,在冰浴中徐徐搅拌,只管即便制止气泡发生,完全消融后,徐徐滴加1%戊二醛溶液4ml,使戊二醛的终极浓度为0.2%,移至室温中静置2h~3h后,以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4℃充实透析或以SephadexG25柱撤除过量的戊二醛,4℃保管备用(也可保管于50%甘油中置高温冰箱);②抗IgG-HRP的制备:将12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,迟缓搅拌下参加1%戊二醛溶液4mL,置室温2h~3h,充实透析或以SephadexG25除戊二醛,小量分装后保管于高温冰箱,制止重复冻融。或冷冻枯燥保管。 
    ⑵ 二步法:是先使酶与戊二醛反响,撤除未反响的戊二醛,再使已“活化”的酶分子与抗体分子的氨基联合,最初参加大批的赖氨酸关闭被戊二醛激活的酶的残基。二步法操纵:将10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室温安排18h,充实透析或以SephadexG25柱撤除未反响的戊二醛。加心理盐水至1ml然后参加1ml(含5mg)的抗体溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液,混淆后4℃冰箱安排24h,参加0.1ml 0.2mol/L赖氨酸,置室温2h,以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充实透析,离心去沉淀,上清液即为酶联合物,再进一步以硫酸铵沉淀纯化后使用。AKP一样平常不接纳二步法,而只用一步法。
    改进HRP二步标志法:取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液中,参加25%戊二醛0.1ml,37℃温育2h后参加酷寒的剖析纯的无水乙醇2ml,2 500r/min离心沉淀10min~15min,倾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml~5ml混悬,同上离心,倾去乙醇,将管颠倒,使乙醇充实流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液消融,参加0.5ml~1ml 抗IgG抗体溶液(含抗体15mg左右),放在冰箱内留宿后,加KH2 PO4,使近中性即可使用。 
    2.氧化法 接纳过碘酸钠,过碘酸钠是强氧化剂,能将HRP的甘露糖局部(与酶活性有关的局部)的羟基氧化成醛基,然后与抗体的氨基联合,构成酶标抗体。 
    (1)氧化法操纵历程如下:将5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸钠中,加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)无水乙醇溶液,在室温中混淆后,再参加1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L过碘酸钠(NaIO4),置室温中轻搅30min,在溶液呈黄绿色时,加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液,在室温中安排1h,使氧化反响中断,然后在4℃中对0.10Mol/L pH 9.5重碳酸钠缓冲液透析,换液3次。在3ml HRP-醛基溶液中,参加5mg(溶于1ml的碳酸盐缓冲液中),室温置2h~3h,参加5mg氢化硼钠(NaBH4),于4℃冰箱安排3h或留宿,然后用PBS液充实透析,离心去沉淀物。上清液即为酶联合物,纯化后利用。
    (2)改进过碘酸钠法:①取5mg HRP溶于0.5ml双馏水中,参加新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml双馏水+128mg NaIO4) 0.5ml,混匀,置4℃30min;② 取出后参加0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml,室温安排30min;③参加含5mg纯化抗体的水溶液1ml,混匀,并装入透析袋,对0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液徐徐搅拌透析6h(或留宿),使之联合;④参加NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml,混匀,置4℃2h;⑤在以上溶液中迟缓参加等体积的饱和硫酸铵溶液,混匀,4℃30min,离心,去上清,沉淀以少许0.02Mol/L pH7.4 PBS液消融,装入透析袋,以异样液体在4℃透析除盐留宿;⑥越日取出离心,以撤除不溶物,即得酶-抗体(HRP-IgG)联合物,以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml;⑦效价测定及格后,参加等量优质甘油,分装小瓶,高温保管。
    表 戊二醛法与过碘酸钠法比力
    比力项目
     
    戊二醛法 过碘酸钠法
     
    一步法 二步法
    标志办法 复杂 较庞大 较庞大
    酶使用率 2~4% 2~4% 70%酶偶联到99%抗体上
    产率 <5% <5% >50%
    标志抗体分子量 750万 <25万 >40万
    穿入构造才能 一样平常
    抗体活性丧失 较多
    酶活性丧失 较多
    染色效应 较好 较好
    3.二马来酰亚胺法 二马来酰亚胺(Dimaleimide)能与卵白质半胱氨酸的硫基反响。起首用α-巯基乙胺复原卵白质(IgG),并用N、N‘-O-苯二马来酰亚胺活化,然后撤除多余的试剂,最初使含二马来酰IgG与含硫基的β-半乳糖苷酶毗连。详细操纵如下:将抗lgG抗体溶于0.1Mol/L pH5.0醋酸钠缓冲液并对统一缓冲液透析均衡留宿,离心撤除不溶性物质,抗IgG(14mg/2ml)与10mlα-巯基乙胺在37℃温育90min。过Sephadex后稀释使每ml含3.0mg左右的复原抗IgG。在0℃中,按1︰1滴加饱和N、、N‘-O-苯二马来酰亚胺溶液,混淆,于30℃温育20min,过SephadexG25柱,撤除未反响的二马来酰亚胺。搜集二马来酰亚胺“活化”的抗IgG,稀释使浓度为OD280nm=1.0(光径1cm),取1ml溶液加20μl(5mg/ml)β-半乳糖苷酶,置30℃20min,用0.10Mol/L NaOH中和后,于4℃置24h~72h,再过Sepharose-6B柱(1.5×40cm),以pH7.0PBS洗脱,搜集酶联合物,加叠氮钠(NaN3)防腐,4℃保管备用。
    (一)   酶标抗体联合物的纯化 
    在酶标志的溶液中,呈现的是种种交联物的混淆物,有酶-抗体、酶-抗体-酶、抗体-抗体、酶-酶,乃至另有游离的酶和抗体。在这两头,除了抗体-酶和酶-抗体-酶外,别的都应该赐与撤除。 
    1.50%饱和硫酸铵沉淀法。 此法只能撤除游离的酶及酶-酶聚合体。而不克不及撤除别的不必要者。但此法对酶标抗体的消耗少。 
    2.过SephadexG200或Sepharose-6B柱。此法较繁琐,并且对酶标抗体的消耗较大,但提纯的质量好。 
    (三)酶标抗体的判定
    1.酶标抗体的活性判定 一样平常以琼脂分散和免疫电泳举行判定。使酶标抗体和响应的抗原(抗原浓度为1mg/ml)发生沉淀线,洗濯后于底物溶液中显色,显色后用心理盐水漂洗,沉淀线不褪色,阐明酶和抗体都具有活性。精良的酶标联合物琼脂分散滴度一样平常应在1:16以上。 
    2.酶联合物的定量测定 包罗酶量、IgG含量、酶与IgG克分子比值以及联合率的测定。
    酶量(µg/ml)=OD403nm×0.42     
    (1)戊二醛法:IgG(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62 
    (OD403×0.42为酶在403nm的光密度,抗体与酶-戊二醛联合后OD280nm约增长6%,以是乘以0.94校正。由于兔IgGOD280nm=1.0时为0.62mg,以是又乘以0.62)。 
    (2)过碘酸钠法:IgG(mg/ml)=(OD280-OD403×0.30)×0.62
    \
    (40 000和160 000辨别为辣根过氧化物酶和IgG的分子量)。
    ⑷ 酶联合率=联合物中的酶量/标志时参加的酶量×100%。
    ⑸ 酶标志率:OD403nm/OD280nm即酶中正铁血红素辅基的吸光度(403nm)与抗体-酶卵白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度(280nm)之比表现HRP在AbE中所占的比例,它与E/Ab克分子比值呈高度正相干。
    3.酶联合物的质量尺度 纯化的酶联合物的质量尺度应包罗以下几个方面。
    (1)酶的催化活性。
    (2)免疫学活性。 
    (3)未联接的游离酶的量。
    (4)未联接的原始免疫反响物的量。
    (5)每个酶分子所联接的免疫反响物分子数量。 
    (6)生化性子。
    (7)酶标志免疫实验结果。
    酶联合物的质量差别,可惹起实验敏感度的很大变革。比方用差别的步伐制得的HRP-IgG联合物举行酶标志免疫实验,可失掉差别的实验后果,故应予器重。
                表 用于ELISA酶标抗体的各项目标参数
    评价 最好 一样平常
    酶联合量(mg/ml)  ≥1.0 ≥0.5 0.4
    酶联合率(%) >30  9~10 7
    酶IgG克分子比 >1.5 1.0 0.7
    (五)酶标抗体的保管
    分装小瓶,冻干高温保管。也可分装小瓶,在4℃或0℃以下保管。加甘油或牛血明净卵白(最初浓度为33%)保管更好。制止重复冻融。保管期:一样平常1~2年活性稳定。
     
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